2025年7月31日，山西農業大學王升級團隊在Industrial Crops&Products期刊發表了一篇題為“ERF194 regulates poplar leaf development via the starch and sucrose metabolism under natural environments"研究論文。本研究聚焦楊樹ERF194轉錄因子，借助DAP-seq技術揭示了其通過調控淀粉-蔗糖代謝通路影響葉片發育的分子機制，為楊樹遺傳改良提供理論與實驗依據。藍景科信為該研究提供了DAP-seq技術支持。

文章主要內容

研究背景

葉片是植物光合作用的核心器官，其形態與結構直接影響植物生長效率與抗逆能力。ERF轉錄因子家族作為植物的調控因子，在生長發育與逆境響應中發揮關鍵作用，但此前其在楊樹葉片發育中的具體調控機制，尤其是與碳代謝通路的關聯尚未明確。

團隊前期研究發現，室內條件下過表達ERF194會導致楊樹出現半矮化表型，但該表型在自然環境中的穩定性及背后的分子機制尚不清楚。

為探索上述問題，團隊引入多組學分析策略，并借助藍景科信DAP-seq技術，深入挖掘ERF194的下游靶基因，最終揭開了其調控葉片發育的分子密碼。

研究結果

1. 田間表型驗證：ERF194抑制葉片大小，增強葉片結構致密性

為評估自然環境條件下ERF194調控楊樹葉片發育功能的穩定性與保守性，對經過田間持續修剪的1年生轉基因楊樹進行了表型檢測。結果顯示，在自然環境條件下，ERF194過表達顯著抑制楊樹的株高和基莖生長，而RNAi株系與野生型無明顯差異，表明ERF194對楊樹生長的抑制作用穩定且不受環境影響。葉片形態分析顯示，OE株系第15片成熟葉的葉長、葉寬、周長和面積均顯著小于WT，RNAi株系與WT無顯著差異，表明ERF194在楊樹葉片表型調控中發揮抑制作用。葉片內部結構觀察結果顯示，盡管ERF194過表達導致葉片變小和中脈變薄，但整體葉片厚度顯著增加。OE株系的葉片細胞間隙減少，組織結構更致密，柵欄組織和海綿組織均顯著增厚，上表皮細胞變小但密度增加。而RNAi株系與WT結構相似，表明ERF194促進細胞分裂、抑制細胞擴張，表明，ERF194在改變楊樹葉內部結構方面起關鍵作用。

圖1. ERF194抑制楊樹在自然環境條件下的生長

圖2. 在自然環境條件下ERF194可減小楊樹葉大小

圖3. ERF194增加葉片厚度和內部細胞的致密性

2. 代謝機制解析：靶向抑制淀粉-蔗糖代謝關鍵產物，限制葉片生長

為深入了解葉片內部變化的潛在機制，作者對葉片進行了代謝組學分析，共檢測到308種代謝物，其中76種在過表達株系中表現出顯著差異。KEGG富集分析顯示這些差異代謝物主要參與淀粉和蔗糖代謝、次生代謝物合成等通路。其中過表達株系中α,α-海藻糖和6-磷酸海藻糖含量顯著下降，OE株系葉片中蔗糖含量比WT降低15-37.6%，上述結果表明，ERF194基因的過表達會抑制楊樹葉片中 α,α- 海藻糖和6 - 磷酸海藻糖的合成，進而導致蔗糖含量下降。進一步通過RNA-seq分析，鑒定出2028個DEGs（1057上調、971下調），其中17個參與淀粉和蔗糖代謝。代謝組與轉錄組數據聯合分析顯示，差異表達基因與差異代謝物之間存在強相關性，差異代謝物α,α- 海藻糖、6 - 磷酸海藻糖，與17個差異表達基因共同富集于淀粉與蔗糖代謝通路，ERF194通過調控這17個差異表達基因的表達，在淀粉與蔗糖代謝中發揮關鍵作用。

圖4. 過表達ERF194的轉基因楊樹（OE）與WT樣本的代謝組學和轉錄組學分析

圖5. ERF194參與調控淀粉代謝途徑

3. 調控網絡構建：DAP-seq助力鎖定“上游 - 核心 - 下游"完整調控鏈

為探究ERF194的下游基因，作者開展了DNA親和純化測序（DAP-seq）分析，在全基因組范圍內篩選ERF194結合的DNA位點，為調控網絡解析提供精準靶點：

l靶基因篩選：DAP-seq 結果顯示，ERF194可結合19條染色體上的15152個位點，其中6127個位于基因啟動子區，通過與轉錄組DEGs聯合分析，鎖定287個核心靶基因，其中6個參與淀粉和蔗糖代謝，包括直接靶基因HKL1和FRK1；

l關鍵motif鑒定：發現ERF194通過識別LTRE（YCACCGACMHH）和SORLIP1（CCDCCRCCRCC）兩種保守motif結合靶基因啟動子，酵母單雜交（Y1H）實驗驗證了該結合的特異性；

l調控模塊確立：結合多層級基因調控網絡（ML-hGRN）分析，最終構建 “SRM1/MYB61（上游調控因子）-ERF194（核心因子）-HKL1（下游靶基因）" 調控模塊，通過雙熒光素酶實驗驗證了ERF194可直接結合HKL1啟動子并激活其表達，進而抑制海藻糖合成，完成對葉片發育的調控。

圖6. 通過DAP-seq和Y1H鑒定楊樹全基因組中ERF194的下游靶點

圖7. 由ERF194介導的多層級基因調控網絡

圖8. ERF194調控楊樹葉發育的機制模型