文章標題：Identification of plasma miR-4505, miR-4743-5p and miR-4750-3p as novel diagnostic biomarkers for coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a case-control study
發表年限：2024年
期刊：Cardiovascular Diabetology
影響因子：8.5
研究背景
2 型糖尿病（T2DM）和冠狀動脈疾病（CAD）是常見的共存臨床疾病，在全球范圍內的發病率仍在增長。最近，循環RNA（miRNA）已成為心臟代謝疾病中的新型分子參與者。本研究旨在確定特異性 miRNA 特征作為 T2DM 中 CAD 的候選生物標志物，并描繪導致糖尿病動脈粥樣硬化的潛在 miRNA 依賴性機制。
研究方法
共收集來自患有和不患有 CAD 的 T2DM 患者、CAD 患者和健康對照的 38 份血漿樣品，使用微陣列對 2,578 個 miRNAs 進行表達譜分析。為了研究差異表達 （DE）-miRNA 靶基因的調控作用，利用多種生物信息學工具進行了功能注釋和通路富集分析。然后，利用 Cytoscape 軟件中的 STRING 數據庫建立蛋白質-蛋白質相互作用網絡，進行聚類分析和樞紐基因鑒定。在 94 名參與者的較大復制隊列中進行逆轉錄定量實時聚合酶鏈反應 （RT-qPCR） 以驗證微陣列數據。采用受試者工作特征分析評價 miRNAs 的診斷價值。采用多因素 logistic 回歸分析開發基于 miRNA 的診斷模型。
本文中通過Cytoscape v3.10.0 軟件中的STRING數據庫插件（stringApp v2.0.1）進行蛋白質互作網絡構建，來確定已驗證的差異miRNA在T2DM-CAD中的調控作用，綜合置信度得分大于0.4的相互作用被保留。然后使用Cytoscape v3.10.0軟件中的分子復合物檢測（MCODE v2.0.3）插件來于深入了解PPI網絡中可能緊密連接的基因模塊（簇、子網絡），并進行富集分析（Figure 1）。通過Cytoscape v3.10.0 軟件中的 CytoHubba 插件過濾PPI網絡，找到關鍵中心基因（Figure 2）。
Figure 1：
Figure 2：
Cytoscape是一個開源的軟件平臺，用于可視化分子相互作用網絡和生物途徑，適用于復雜網絡分析，同時也具有很多實用性的插件。今天我們來一起用軟件和插件，按文章中的邏輯和操作步驟，來畫一個蛋白質互作網絡圖。
Cytoscape在windows平臺只有64位版本在Cytoscape獲取最新下載地址，請注意，Cytoscape安裝需要配套的Java運行環境，所以需要先安裝Java，安裝好后再進行Cytoscape的安裝，根據安裝提示進行下一步即可。
安裝Java后，需要配置環境變量，在電腦開始菜單搜索“編輯系統環境變量"（win 11），點擊環境變量：
新建系統變量，變量名輸入JAVA_HOME，變量值輸入Java安裝路徑，點擊確定保存：
編輯Path環境變量，新建一行輸入Java路徑，點擊確定保存即可完成環境變量配置。
開始菜單輸入cmd，繼續輸入java -version查看是否安裝成功，Java版本：
這里我們安裝的Cytoscape版本是3.10.3，Java版本為17.0.13，安裝好后我們來了解一些基礎功能。
打開Cytoscape后，啟動面板可以大致分為以下幾部分內容：
1.菜單
●File：文件菜單。可以進行文件的導入和輸出，常用選項有：
? Import：導入網絡或表格。
? Export：導出網絡圖片或表格，也可導出為網頁。
? Open Session / Open Recent Session：可以打開 Cytoscape 文件或列出最近打開的會話文件，以便快速訪問。
? New Network：創建新網絡，可以編輯空白網絡，也可以從一個現有網絡創建。
? Save Session：保存會話文件。
●Edit：編輯菜單。可以進行撤銷重做等。撤消和重做功能適用于最近執行的 10 個任務。可以將注釋向前、向后以及將其推或拉到前景層和背景層，常用選項有：
? Undo/Redo：將所有已刪除的節點和邊進行恢復或重做。
? Destroy Networks/Views：刪除網絡或刪除現有的視圖，再次create view后回到初始風格狀態。
? Remove Duplicated Edges：用于刪除重復的邊（具有相同的源節點和目標節點），只保留一條邊。
? Remove Self-Loops ：用于刪除具有相同的源和目標節點的邊。
? Remove Selected Nodes and Edges：用于刪除選定的節點和邊。
●View：視圖菜單。可以顯示或隱藏各個窗口，也可以進行放大縮小或適配網絡視圖。
●Select：選擇菜單。可以選擇點或邊進行展示和隱藏。
●Layout：布局菜單。可以手動調整節點位置，也可以通過布局菜單中的預設布局算法進行網絡圖布局的調整，這些布局算法也可以將節點和邊的數據列考慮進去。常規布局有：
? Layout Tools：節點布局工具，可以幫助自動化或微調布局。選擇個別節點或全部節點，可以對邊的長度、方向進行調整，也可以設置節點相對位置。
? Grid Layout：網格布局，所有節點排列成方形網格。
? Hierarchical Layout：分層布局，展示網絡中的主要方向，節點被放置在按層次排列的層級中，通過最小化邊的交叉數量對每個層內的節點進行排序。
? Circular Layout：環形布局，強調網絡中的分組和樹狀結構，通過分析結構的連通性對網絡進行分組，并將分組結果布局成單獨的圓，圓本身以放射狀樹形布局的方式進行排列。
? Stacked Node Layout：堆疊節點布局，將節點縱向堆疊排列進行布局。
? 還有一些通過安裝插件實現的布局選項，根據實際效果選擇合適美觀的布局操作。
●Apps：應用菜單。可以進行插件管理，為已安裝的插件提供菜單選項。常用的插件有：
? stringApp：從Cytoscape內導入string-db的蛋白質互作網絡。
? MCODE：對網路中節點和邊進行聚類分析。
? CytoHubba：過濾互作網絡，篩選核心基因。
? yFiles Layout Algorithms：更多網絡圖布局。
●Tools：工具菜單。包含多種高級功能，如下所示：
? Analyze Network：網絡分析，查看節點、邊、連接的數量，網絡直徑、半徑、聚類系數等。
? Enrichment Table：富集分析，需要有與查詢基因相關的物種及gene symbols。
? Open Web Page：可以打開瀏覽器窗口，快速查看Cytoscape特定網頁。在作圖時參考Cytoscape使用手冊的內容。
●Help：幫助菜單。可以查看用戶使用手冊。
? Citations：可以查看Cytoscape的主要參考文獻和已安裝插件的參考文獻。
2. 常用功能圖標
這些功能也可以通過菜單使用。將鼠標指針懸停在圖標上，短暫停留將會顯示該工具的提示信息，右擊工具欄可以自定義內容。
a.從Network Data Exchange (NDEx)中導入或導出網絡。
b.打開或保存網絡文件（.cys）。
c.從文件中導入網絡或導入表格，添加到目前的網絡中。
d.針對網路主視圖窗口的可視化操作，放大、縮小、適配屏幕、選擇部分節點適配屏幕。
e.恢復網絡的初始狀態。
f.找到選中節點的鄰近節點，可以多次點擊；隱藏選中節點和邊；顯示被隱藏的節點和邊。
g.使用選擇的節點和邊形成自網絡。
h.富集分析。
3. 網絡面板
修改節點、邊、網絡的樣式，包括顏色、節點大小、字體、形狀等，也可以修改網絡圖整體背景顏色。
4.顯示網絡的主網絡視圖窗口
顯示網絡圖，可以同時顯示多個網絡圖窗口，網絡視圖底部是一系列視圖工具。將鼠標指針懸停在圖標上，短暫停留將會顯示該工具的提示信息。
a.將所有已經加載的網絡以網格樣式排列各個窗口視圖；顯示當前選擇的網絡。
b.獨立網絡視圖窗口，將網絡圖窗口與軟件主窗口分開。
c.導出網絡或網絡圖。
d.強制渲染圖形細節（默認關閉）；關閉或打開節點選擇；關閉或打開邊選擇；關閉或打開注釋選擇；關閉或打開節點或邊的標簽選擇。后四個選項影響你在視圖窗口中是否能選擇拖動節點、選擇邊，移動節點標簽等。
e.隱藏鳥瞰視圖。在大型網絡圖中方便查看每個位置的節點。
5.表格面板
顯示節點和邊的數據，可以修改相應數據。導入或導出表格，添加或刪除表，還可以篩選想要顯示的列。
6.命令面板
可以讀取和執行腳本文件，文件中每行為發送到應用的命令。
插件可以直接在Cytoscape App Store進行搜索下載。
也可以在Cytoscape中的App Store →Show App Store中進行查找，跳轉對應插件網頁，相比直接的網頁搜索效果更精確，網頁搜索會將包含相應單詞的插件都顯示出來。
進入網頁后下載插件文件，下載好后回到Cytoscape，選擇Install Apps From File 進行安裝。這里我們安裝了stringApp、MCODE和CytoHubba，嘗試復原文獻中的蛋白互作網絡圖的樣式。
首先我們可以下載得到開頭文章中所用的互作網絡數據，如圖，Table 5中是作者構建的12個差異miRNA驗證靶基因的PPI網絡。其中，3個（hsa-miR-4505, hsa-miR-4743-5p, hsa-miR-6846-5p）上調，共341個靶基因，9 個（hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-4668-5p, hsa-miR-4706, hsa-miR-6511b-5p, hsa-miR-6750-5p, hsa-miR-4750-3p, hsa-miR-320e, hsa-miR-4717-3p, hsa-miR-7850-5p）下調，共1991個靶基因。這里我們用上調的miRNAs涉及到的靶基因進行作圖，共341個。
第一步：使用Cytoscape中的STRING數據庫，鑒定網絡圖存在的節點和邊。
1. 通過File→Import→Network from Public Databases，導入互作網絡數據庫。
2.切換至STRING：protein query，選擇對應物種，輸入靶基因列表，其余參數可以保持默認狀態，也可以根據需要自行選則。
其中Network type是指網絡類型，默認選擇full STRING network，指保留全部來源的互作網絡，既有實際證據證明的，也包含基于臨近基因、文本檢索、共表達、共定位等預測的可能存在的蛋白相互作用。 physical subnetwork則僅保留存在實質結合或形成蛋白復合體的相互作用。Confidence (score) cutoff指互作置信度篩選值，在STRING中，0.4為中等可信度，0.7為高可信度，0.9為最高可信度，0.15為較低可信度。Maximum additional interactors 指附加的互作蛋白數量最大值，最多可添加的互作數量，可以將原始查詢中未包含但預測到會發生相互作用的蛋白質添加到網絡中。Use Smart Delimiters可以使用只能分隔符正確分隔輸入的蛋白質名稱和標識符。Load Enrichment Data指加載富集數據對蛋白進行富集分析。
3.導入后即可獲得相應的蛋白質互作網絡圖，可以通過右側選項更改圖片呈現樣式，修改標識符位置，隱藏或顯示單獨節點，點擊任意節點可以查看對應蛋白的描述和結構。
還可以通過Tools→Analyze Network分析網絡，查看點和邊的數量等信息。
第二步：使用Cytoscape中的MCODE 插件，對所有節點和邊進行聚類分析。
1. 首先打開Apps→MCODE，參數一般維持默認即可。其中，Find Clusters，可以從全部網絡圖中尋找，也可以從選定的節點和邊中尋找。Include Loops，選擇后MCODE會包含循環的邊(self-edges)。Degree Cutoff指對節點評分的最小連接數，如僅與另一個節點共享一個節點的Degree值為1，有效最小數值為2，防止單連接節點人為的獲得高節點數。Haircut，指一些滿足Degree Cutoff的節點可能僅通過一條邊連接到集群，Haircut會刪除這類單連接節點。K-Core：過濾掉不包含最少K 值的最大互連子集群的集群，子集群中的節點degree都要大于K。 Max.Depth：子節點到集群中其他節點的距離，MCODE可以在該距離內搜索集群的子節點。
分析完成后，可以把每個自網絡單獨輸出，進行調整。
可以通過Layout，選擇合適的布局輸出保存成圖片或文件。
第三步：使用Cytoscape中的cytoHubba 插件，過濾 PPI 網絡，篩選核心基因。
1.點擊左側的cytoHubba工作區，選擇目標分析網絡，點擊calculate，選擇關鍵基因數量排名靠前的十個，使用BottleNeck算法進行分析，或者選擇感興趣的基因。
2.核心基因結果顯示如下，右邊列表為核心基因排名，顏色越深分數越高，說明這個基因越顯著。可以通過style中的各項修改網絡圖樣式，這里我們修改了圖中標識的顯示內容，可以看出PTEN同文章中一樣，是上調miRNA中的關鍵核心基因。
3.同樣的，我們可以調整網絡圖布局進行輸出，得到如下結果：
本次Cytoscape使用介紹就到這里，更多介紹可以查看中文手冊以及相關插件的對應使用手冊。
參考文獻
[1] Szyde?ko J, Czop M, et al. Identification of plasma miR-4505, miR-4743-5p and miR-4750-3p as novel diagnostic biomarkers for coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a case-control study. Cardiovasc Diabetol. 2024;23(1):278.
[2] Locard-Paulet, Marie et al.Functional Analysis of MS-Based Proteomics Data: From Protein Groups to Networks.Molecular & Cellular Proteomics, Volume 23, Issue 12, 100871.
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