【中文題目】一個小核仁RNA(SNORA13)在核糖體生成和衰老中的非經典作用研究
【文章題目】A non-canonical role for a small nucleolar RNA in ribosome biogenesis and senescence
【發表期刊】Cell（影響因子45.5）
【發表時間】2024年8月22日
【研究團隊】美國德克薩斯大學Joshua T. Mendell團隊
【研究概要】
細胞衰老是一種由各種應激引起的不可逆的細胞周期停滯狀態，包括異常的癌基因激活、端粒縮短和DNA損傷。通過全基因組篩選，研究者發現了保守的小核仁RNA (snoRNA) SNORA13，它在人類細胞和小鼠的多種衰老形式中是必需的。盡管SNORA13指導核糖體解碼中心保守核苷酸的假尿苷化，但失去這種snoRNA對翻譯的影響很小。然而，SNORA13能夠負調控核糖體生成。誘導衰老的應激會擾亂核糖體生成，導致游離核糖體蛋白的積累，從而激活衰老細胞中的p53。因此，SNORA13通過非典型的分子機制調節核糖體生成和p53通路，這種機制與其指導RNA修飾的作用不同。這些發現擴展了我們對snoRNA功能及其在細胞信號傳導中作用的理解。
【主要實驗】
CRISPRi篩選、RNA熒光原位雜交(FISH)、嘌呤霉素摻入實驗、核糖體分析(Ribo-seq、Polysome profiling)、RNA-seq、ChIP實驗、質譜分析、UV-RIP實驗、突變體構建、小鼠體內實驗
【研究背景】
在非轉化細胞中，由異常的癌基因激活導致的不可逆的細胞周期停滯狀態，稱為癌基因誘導的衰老 (OIS)。雖然已經確定了大量參與衰老程序的編碼基因，但非編碼RNA在細胞衰老中的作用仍然知之甚少。一類與衰老相關的非編碼RNA—小核仁RNA (snoRNA)，傳統上snoRNA通常可以引導其他RNA化學修飾。大多數snoRNA在編碼或非編碼轉錄本的內含子中編碼，在剪接過程中切除宿主內含子后，被加工成60-300個核苷酸的成熟形式。除了可以引導RNA修飾，snoRNA還執行各種其他功能，包括調節前mRNA剪接和通過類似miRNA的機制調節靶mRNA。
【研究結果】
首先，該研究通過CRISPRi技術篩選到了一個OIS相關的非編碼RNA—EPB41L4A-AS1，它是一個高度保守的H/ACA盒snoRNA SNORA13的宿主轉錄本。進一步研究發現，敲低EPB41L4A-AS1阻止了HRASG12V誘導的細胞衰老，使細胞持續增殖，表明EPB41L4A-AS1和其編碼的SNORA13在OIS中至關重要。隨后，利用CRISPR技術對SNORA13進行敲除，但保證剪接后的EPB41L4A-AS1轉錄本正常表達。進一步通過致癌基因誘導實驗、回補實驗、DNA損傷處理實驗，證明了SNORA13是多種形式衰老所必需的，而非剪接后的EPB41L4A-AS1轉錄本。
圖1. 鑒定了一個OIS相關的非編碼RNA—EPB41L4A-AS1，其編碼SNORA13
接下來，深入研究了SNORA13參與衰老的分子機制。細胞分離和FISH實驗證明，SNORA13定位于核仁，且致癌基因誘導后不影響該snoRNA的定位及整體表達。通過多種分析證實了SNORA13是18S.1248U假尿苷化所必需的。由于18S:1248U位點上m1acp3?修飾在真核生物中是保守的，這種核苷酸修飾定位于核糖體解碼中心，于是推測SNORA13缺失可能會影響編碼衰老調節因子mRNA的翻譯。隨后，通過嘌呤霉素摻入實驗發現，在正常生長情況下SNORA13缺失后整體翻譯沒有明顯變化。不過，在致癌基因誘導下缺失SNORA13的細胞中翻譯水平有所增加，但這可能是由于這些細胞相對于野生型細胞持續增殖的次要后果，因為p53的缺失也會導致這些條件下翻譯的增加。
對野生型和敲除SNORA13的BJ-HRASG12V細胞進行Ribo-seq和RNA-seq分析，發現在SNORA13敲除的細胞中，只有少數轉錄本顯示出翻譯效率（TE）的顯著改變。密碼子分析發現，富含A/U的轉錄本TE增加，富含G/C的轉錄本TE反而降低，這與之前的研究結果相似。在正常生長情況下，SNORA13缺失對密碼子使用特異性影響極小。以上結果表明，SNORA13不太可能通過改變整體翻譯效率、轉錄本或密碼子特異性來調節衰老。此外，研究者注意到與之結果不同的另一項研究，即敲除TSR3后的翻譯及隨后18S rRNA中該位點acp3修飾的缺失，這影響了核糖體蛋白（RP）編碼mRNA的翻譯。這種差異可能是由于隨后添加acp3并不需要該核苷酸的假尿苷化。
圖2. Polysome profiling繪制核糖體圖譜
采用Polysome profiling分析敲除SNORA13的BJ-HRASG12V細胞中核糖體亞基和翻譯核糖體豐度。結果發現，在SNORA13敲除細胞中，無論致癌基因HRASG12V激活與否，游離60S亞基和單核糖體80S的穩態豐度均顯著增加。隨后，利用一個表達內源性SNAP標簽的大核糖體亞基蛋白RPL28的HEK293T細胞系，監測60S核糖體亞基生成。SNORA13基因缺失會導致總的及新形成的60S核糖體亞基和80S單核糖體豐度增加。使用EDTA將多核糖體解聚成游離的核糖體亞基，也證實了SNORA13的缺失會增加60S亞基的穩態豐度。此外，與野生型相比，在敲除SNORA13的細胞中新標記的RPL28會更快從核仁中消失，即更快組裝成60S并進入細胞質中。總之，SNORA13參與了細胞在生理條件下對核糖體生成的調控，并在營養缺乏時抑制核糖體的生成。因此，SNORA13是核糖體生成的一個強負調控因子。
圖3. SNORA13通過核仁應激反應途徑調節p53的活性
通過基因集富集分析（GSEA）分析發現，在SNORA13敲除細胞中p53通路活性下降。在致癌基因誘導后，大量的p53蛋白定位于細胞質，且p53與靶基因CDKN1A啟動子區域的結合顯著減少。SNORA13敲除還會導致MDM2蛋白活性增強，從而抑制p53的核積累和轉錄激活活性。而癌基因誘導的核仁應激反應，可以通過游離的RP與MDM2結合來抑制MDM2活性。敲除SNORA13后，由于60S亞基生成加速，游離RP減少，導致MDM2對p53的抑制作用增強，最終阻礙了細胞衰老。這些結果表明，SNORA13通過核仁應激反應途徑調節p53的活性。
之后，研究者構建了SNORA13的突變體，發現SNORA13突變后喪失了引導假尿苷化修飾，但仍能與RPL23結合，而且突變體可以恢復SNORA13敲除導致的細胞衰老表型。此外，與敲除SNORA13基因相反，敲除EMG1和TSR3（分別催化18S:1248U的N1甲基化和acp的添加）后，當HRASG12V表達激活下進入細胞衰老。以上結果說明，SNORA13通過一種不同于引導假核苷化的非典型機制來調節核糖體的生成和衰老。
圖4. SNORA13直接與核糖體蛋白RPL23相互作用，抑制RPL23：28S rRNA相互作用
利用反義寡核苷酸（ASOs）從紫外交聯的細胞中分離內源性SNORA13核糖核蛋白復合物（RNP）做質譜分析，鑒定到幾種顯著富集的互作蛋白，其中包括大核糖體亞基組分RPL23。UV-RIP實驗進一步證實了SNORA13與RPL23的特異性結合。同樣地，使用ASOs從紫外交聯細胞中下拉出內源性SNORA13，證明了RPL23的特異性共純化。這些結果表明，SNORA13直接與RPL23相互作用，并且這種相互作用發生在核糖體亞基組裝完成前。體外實驗進一步證實，重組RPL23可以與SNORA13形成復合物，但不能與SNORA25形成復合物。因此，SNORA13直接與RPL23相互作用，抑制RPL23：28S rRNA相互作用。基于以上結果，研究者提出SNORA13通過抑制RPL23整合到正在成熟的60S亞基中來負向調控核糖體生成，從而增強致癌基因誘導的核仁應激反應。
最后，在小鼠中鑒定到了三個SNORA13的同源基因，且僅在同時敲除三個同源基因后才會導致60S亞基增加，這與人類細胞中的表型一致。這表明小鼠SNORA13同源基因功能冗余，共同調控60S亞基生成。之后，利用OIS小鼠模型，進一步證明了SNORA13對體內OIS過程至關重要，且其在調控衰老的作用在人類和小鼠中保守。
【Polysome Profiling技術介紹】
基因表達在多個層面上受到調控，包括：表觀遺傳水平調控、轉錄水平調控、翻譯水平調控以及翻譯后修飾調控。其中，翻譯調控控制著蛋白質的生物合成以響應生理和病理的變化。而且，翻譯水平的調控也深刻影響了蛋白質的豐度。
研究翻譯水平的調控機制，有助于深入理解基因表達調控機制，并且可以解釋轉錄組和蛋白質組分析之間的差異。多聚核糖體分析（Polysome profiling）是研究翻譯調控機制常用的技術。Polysome profiling基于蔗糖梯度分離出free mRNA、40S核糖體亞基、60S核糖體亞基、80S monosome以及Polysome等組分。
Polysome profiling可用于特定mRNA的目標分析以及翻譯整體分析。此外，也可以獲取正在翻譯的全長mRNA，包括非翻譯區（UTR）。UTR含有選擇性翻譯的順式作用元件。鑒定UTR中調控翻譯的順式作用元件，對于解析基因表達調控的機制至關重要。此外，Polysome profiling可以與免疫印跡或蛋白質組學聯合使用，用于鑒定與核糖體結合或者與翻譯起始相關的蛋白質。最后，Polysome profiling特別適合于尚未進行全基因測序或者遺傳轉化操作困難的物種。
【參考文獻】
Chassé H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017, 45(3):e15. doi: 10.1093/nar/gkw907.
Cheng Y, Wang S, Zhang H, Lee JS, Ni C, Guo J, Chen E, Wang S, Acharya A, Chang TC, Buszczak M, Zhu H, Mendell JT. A non-canonical role for a small nucleolar RNA in ribosome biogenesis and senescence. Cell. 2024, 187(17):4770-4789.e23. doi: 10.1016/j.cell.2024.06.019.
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