2024年3月6日，林木遺傳育種全國重點實驗室、北京林業大學生物科學與技術學院尹偉倫與夏新莉教授課題組在New Phytologist（中科院一區，影響因子9.4）期刊發表了題為“The miR6445-NAC029 module regulates drought tolerance by regulating the expression of glutathione S-transferase U23 and reactive oxygen species scavenging in Populus"的研究論文，揭示了miR6445-NAC029-GSTU23模塊通過調節活性氧穩態在提高楊樹抗旱性中的關鍵作用。

前期研究表明miR6445是楊樹特異性miRNA，它可以靶向NAC (NAM、ATAF和CUC) 家族基因，然而，在楊樹中，miR6445和NAC基因相互作用的生物學功能尚不清楚。該研究發現了miR6445-NAC029調控模塊參與楊樹干旱脅迫響應中的作用。miR6445和NAC029都對干旱脅迫都有響應，但表現出不同的表達模式。基于短串聯靶模擬物 (STTM) 誘導的基因沉默實驗，證明了miR6445對楊樹干旱脅迫耐受性有正調控作用。研究人員在楊樹中過表達及敲除NAC029，發現NAC029的過表達導致楊樹干旱敏感性增加，表現為干旱脅迫下植物萎蔫加劇、膜損傷加劇、脂質過氧化增加、保水能力降低和光合效率降低，活性氧含量增加。Crispr-NAC029則表現出相反的表型（圖1）。

圖1 NAC029負向調控楊樹耐旱性。

通過轉錄組學測序，作者發現了幾種可能受NAC029調控的生物學過程，特別是超氧化物和活性氧代謝過程。進一步研究發現NAC029可以通過直接靶向并抑制GSTU23活性來調節活性氧穩態，從而在干旱脅迫中發揮作用（圖2）。此外，GSTU23的過表達顯著增強了楊樹的抗旱性，表現為干旱脅迫下保持了更好的植株形態，減少了膜損傷，降低了脂質過氧化，改善了光合性能，增強了GST活性，降低了活性氧水平（圖2）。這項研究揭示了一個楊樹的miR6445-NAC029-GSTU23調控模塊，它可以維持活性氧平衡，這對楊樹的抗旱性至關重要，這一發現對楊樹抗旱性遺傳改良提供了新的分子靶點。

圖2 miR6445/NAC029在正常條件和干旱脅迫下的功能調控模型。

該研究中，對轉基因植物進行深入的分子層面表征是及其關鍵的。下一代測序（NGS）技術有效彌補了傳統Southern雜交和PCR方法的不足，不僅能夠快速準確地測定轉基因的拷貝數，更能精確揭示其在基因組中的整合。該研究團隊通過基因組重測序技術（與藍景科信合作），以高通量、高分辨率的方式分別鑒定了過表達NAC029、GSTU23株系的基因拷貝數及插入位點。其中，從OE-NAC029-3楊樹中獲得的跨越宿主基因組與轉基因之間連接區域的讀取序列，發現與84K WT楊樹中有兩個位置對齊，一個是第16染色體從2968653到2968659堿基對，有6個堿基對的缺失，為反向插入，插入位點位于Pop-A16G089982和Pop-A16G089983兩基因之間；另一個位點是第10染色體從19758803到19758805堿基對，有2個堿基對的缺失，為正向插入，插入位點位于Pop-A10G001190和Pop-A10G001189兩基因之間。是一個雙拷貝事件。OE-NAC029-4楊樹在16號染色體6630336bp處發現了靠近左側邊界（LB）的整合位點,右邊界附近的側翼序列（RB）區域未確定，是一個單拷貝事件，插入位點位于Pop-G16G060808基因內部。同樣的，結果顯示，OE-GSTU-1楊樹轉基因被定位在84K楊樹的第5條和第16條染色體上，這是一個雙拷貝事件。在OE-GSTU-2楊樹中，跨越宿主基因組和轉基因之間的連接區域的讀數被映射到84K楊樹的第3條染色體上，這是一個單拷貝事件。

圖3 轉基因株系拷貝數及插入位點分析。