DAP-seq在毛白楊PtoWRKY68等位基因調控干旱脅迫響應機制中的應用

干旱脅迫限制了樹木的生長，并影響其地域性分布。為了應對干旱脅迫，植物進化出了一系列的生理生化反應機制，以保護植物細胞免受損害。因此，研究干旱脅迫下樹木生理和光合作用變化的分子機制，將有助于培育耐旱性樹木新品種，增強林木的生產力和經濟價值。

2023年5月29日，北京林業大學生物學院林木分子育種團隊的研究成果，發表在學術期刊Plant Physiology，文章題目為 “Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus"。該期刊的影響因子為8.005。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq) 技術鑒定了毛白楊轉錄因子PtoWRKY68的結合基序以及靶基因。揭示了PtoWRKY68基因等位變異通過調控ABA信號通路響應干旱脅迫的分子機制，為利用分子育種策略開發耐旱樹木新品種奠定了遺傳基礎。

該研究利用來自不同自然種群的300份中國白楊材料，對7個干旱相關性狀進行全基因組關聯分析（GWAS）。與充足水分條件下相比，在干旱條件下植物的水分利用效率（WUE）、ABA水平、脯'氨酸水平（PRO）均顯著提高，氣孔導度（Gs）、細胞間CO₂濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）、葉綠素含量（Chl）則顯著下降。在干旱條件下，中國西北（NW）和東北（NE）氣候區域的干旱相關性狀變化率明顯高于南部（S）地區。在全基因組水平上，篩選到顯著相關的一個SNP位點，位于Ptom.004G.01096起始密碼子上游1.9Kb（與Gs顯著相關），該基因編碼WRKY家族轉錄因子PtoWRKY68。干旱脅迫下PtoWRKY68的表達水平顯著增加，說明PtoWRKY68可能參與了毛白楊的干旱脅迫響應過程。過表達PtoWRKY68提高了轉基因擬南芥（OE-1和OE-3）的耐旱性，這表明PtoWRKY68是一個植物耐旱性的正調控因子。

圖1. 毛白楊干旱相關性狀的全基因組關聯分析

PtoWRKY68基因序列變異分析，發現WRKY結構域上游的一個12bp indel和WRKY結構域中的三個非同義變異與Gs顯著相關。基于PtoWRKY68基因變異，將毛白楊分為兩個單倍型類群：PtoWRKY68^hap1（已在擬南芥中做了過表達）和PtoWRKY68^hap2。等位基因頻率調查顯示PtoWRKY68^hap1主要分布在NE和NW區域，PtoWRKY68^hap2主要分布在S區域，這與當地降水的趨勢相一致，符合楊樹的地理適應特征。分析還發現PtoWRKY68^hap1材料對干旱的響應明顯高于PtoWRKY68^hap2材料。然而，在干旱脅迫下PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2的上調表達水平相當，所以兩個單倍型群體對干旱脅迫響應的差異并不是由于PtoWRKY68等位基因表達水平的差異所致。在干旱脅迫下，PtoWRKY68^hap1OE的耐旱性強于過表達PtoWRKY68^hap2的轉基因擬南芥植株（PtoWRKY68^hap2OE），且二者都強于WT。此外，與WT和PtoWRKY68^hap2OE相比，PtoWRKY68^hap1OE中WUE、ABA、PRO的值更高，Gs和Tr的值更低。以上結果表明PtoWRKY68^hap1對毛白楊耐旱性的進一步提高，可能與等位基因變異對干旱脅迫的不同響應有關，其中PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2分別為耐旱等位基因和干旱敏感等位基因。

圖2. PtoWRKY68等位基因變異與毛白楊耐旱性顯著相關

隨后，對充足水分和干旱脅迫條件下的差異表達基因（DEGs）進行共表達網絡分析。干旱脅迫下在PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2兩個單倍型群體之間有164個基因的表達存在顯著差異，說明這些基因的表達受到PtoWRKY68等位基因變異的影響。采用DAP-seq技術分別鑒定了PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2的核心結合基序W1-box和W2-box及其靶點。KEGG分析發現靶基因主要富集于防御反應和植物激素信號通路中。基于DEGs、共表達網絡分析和DAP-seq分析，篩選到3個與PtoWRKY68等位基因相關的靶基因：PtoABF2.1、PtoRD26.1、PtoDTX49.1。干旱脅迫下與在PtoWRKY68^hap2材料中相比，在PtoWRKY68^hap1材料中PtoABF2.1和PtoRD26.1的表達量更高，而PtoDTX49.1的表達量更低。因此表明，PtoWRKY68介導了PtoDTX49.1、PtoABF2.1和PtoRD26.1在干旱脅迫下的轉錄調控。

圖3. DAP-seq鑒定PtoWRKY68等位基因潛在的靶基因

基于DAP-seq數據中的結合峰值、熒光素酶報告實驗(DLRA)、凝膠阻滯實驗（EMSA），說明了與PtoWRKY68^hap2相比，PtoWRKY68^hap1對靶基因的啟動子具有更高的親和力。干旱脅迫下與WT和PtoWRKY68^hap2OE相比，在PtoWRKY68^hap1OE中AtABF2和AtRD26的表達水平顯著升高，AtDTX50的表達水平則明顯降低。ABA敏感性實驗說明PtoWRKY68等位基因在ABA依賴的氣孔關閉中起重要作用。隨后還發現與PtoWRKY68^hap2材料相比，PtoWRKY68^hap1材料的失水速度較慢、氣孔關閉速度較快。因此，干旱脅迫下PtoWRKY68^hap1通過增強干旱脅迫信號通路和ABA信號通路以及減少ABA外排，從而增加細胞中的ABA積累，最終增強植物的耐旱性。

圖4. PtoWRKY68等位基因直接結合靶基因的啟動子并調控其轉錄活性

數量性狀位點（eQTL）分析發現PtoSVP.3受干旱脅迫誘導表達，其表達水平與PtoWRKY68呈正相關。EMSA和DLRA實驗驗證了PtoSVP.3與PtoWRKY68啟動子區域的CArG基序結合，促進PtoWRKY68的表達。因此，提出了調控楊樹干旱響應的分子模塊：PtoSVP.3-PtoWRKY68-PtoDTX49.1/PtoABF2.1/PtoRD26.1。為應對干旱脅迫，PtoSVP.3正向調控PtoWRKY68，PtoWRKY68等位基因通過誘導PtoRD26.1和PtoABF2.1的表達以及抑制PtoDTX49.1的表達，進而調控ABA信號傳導和積累來增強楊樹的耐旱性。

圖5. PtoWRKY68調控楊樹耐旱性的分子機制模型

小結：該研究提出了PtoWRKY68調控楊樹耐旱性的分子機制模型。在干旱脅迫下，PtoWRKY68等位基因受PtoSVP.3的正調控，PtoWRKY68^hap1（上圖）等位基因變異增強了其對PtoRD26.1和PtoABF2.1的結合和激活，并抑制了PtoDTX49.1，從而調節ABA外排和信號轉導來獲得耐旱性。PtoWRKY68^hap2（下圖）比PtoWRKY68^hap1具有較低的結合親和力和對下游靶點的激活能力。因此，楊樹PtoWRKY68^hap1材料的抗旱性優于楊樹PtoWRKY68^hap2材料。PtoWRKY68調控模塊的鑒定為深入了解楊樹耐旱性的遺傳基礎提供了新的見解，并為利用分子育種開發耐旱樹木新品種提供了潛在的靶點。

參考文獻：Fang Y, Wang D, Xiao L, Quan M, Qi W, Song F, Zhou J, Liu X, Qin S, Du Q, Liu Q, El-Kassaby YA, Zhang D. Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus. Plant Physiol. 2023 May 29:kiad315. doi: 10.1093/plphys/kiad315.